Il programma basato sull’intelligenza artificiale AlphaFold prevede la struttura tridimensionale di una proteina con notevole precisione. Tuttavia, tende a ridurre le strutture eterogenee a una singola conformazione dominante, trascurando le condizioni sperimentali che possono alterare la struttura locale. I ricercatori dell’Istituto di Scienza e Tecnologia Austriaco (ISTA) e i loro collaboratori internazionali hanno ora sviluppato un metodo per guidare AlphaFold con dati sperimentali. Il loro approccio, pubblicato su Nature Biotechnology , apre la strada a futuri modelli predittivi più efficaci.
La nostra comprensione delle strutture molecolari è notevolmente influenzata dalla cristallografia a raggi X, una tecnica che per molti decenni ha rappresentato il pilastro centrale della biologia strutturale. Se da un lato le strutture cristalline hanno dato un contributo immenso alle nostre conoscenze biologiche, mediche e farmaceutiche, dall’altro hanno anche rafforzato l’idea che le strutture molecolari siano statiche.
Inoltre, le strutture cristalline spesso permettono di individuare caratteristiche strutturali riconoscibili nelle proteine ripiegate, come le alfa eliche, i filamenti beta e i foglietti beta. Al contrario, le regioni più flessibili, spesso assenti, come le anse, sono rappresentate da linee tratteggiate che collegano le parti visibili della molecola. Il problema: queste regioni non sono semplici elementi di collegamento privi di significato biologico.
AlphaFold , uno strumento di intelligenza artificiale che ha rivoluzionato la biologia strutturale e si è aggiudicato il Premio Nobel per la chimica nel 2024, come altri modelli predittivi, è stato addestrato su strutture cristalline statiche. Queste strutture dominano i set di dati proteici, rappresentando circa l’85% del Protein Data Bank (PDB) . Tuttavia, gli scienziati sono diventati sempre più consapevoli che i movimenti lungo l’intera struttura di una proteina sono essenziali per la sua funzione.
Guidando AlphaFold con dati sperimentali, un team internazionale di ricercatori si propone ora di modellare insiemi di strutture che riflettano meglio la realtà fisica e biologica.
“Le proteine sono molecole altamente dinamiche”, afferma Alex Bronstein, professore presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia Austriaco (ISTA). “Essere in grado di modellare questo dinamismo con AlphaFold, guidato da esperimenti, metterà in evidenza l’importanza funzionale dei movimenti delle proteine.”
Bronstein ha condotto questo lavoro insieme ad Ailie Marx dell’Università di Tel-Hai di Kiryat Shmona e del MIGAL—Istituto di ricerca sulla Galilea in Israele, al professor Paul Schanda dell’ISTA e a Sanketh Vedula, ricercatrice post-dottorato presso l’Università di Princeton e il Broad Institute negli Stati Uniti.
Sviluppo di un nuovo linguaggio grafico
I progressi compiuti nel campo della biologia strutturale nel corso dell’ultimo secolo hanno portato i biologi a sviluppare un vocabolario visivo per le strutture statiche, che include termini come “elica” e “rappresentazione a fumetti”. Secondo Bronstein e il suo team, questo vocabolario visivo limita la comprensione della natura dinamica delle strutture molecolari. Pertanto, il loro obiettivo è ora quello di sviluppare un nuovo linguaggio grafico in grado di trasmettere l’eterogeneità strutturale.
“Spesso, i biologi strutturali hanno giustificato la mancanza di densità molecolari nei loro modelli cristallografici affermando che la regione proteica in questione era ‘flessibile’. Questa spiegazione univoca non ci soddisfa più. Vogliamo affrontare tutte le domande a cui i cristallografi non sono riusciti a rispondere in passato”, afferma Bronstein.
Riordinare i database delle proteine
Quando si predicono le strutture molecolari a partire dalle sequenze, AlphaFold incorpora già alcune informazioni evolutive. Ad esempio, utilizza le relazioni strutturali tra residui che si sono co-evoluti. Tuttavia, applica queste informazioni in modo rigido a proteine diverse, senza tenere conto del contesto della sequenza e della struttura complessiva di ciascuna proteina.
L’approccio del team affronta questa limitazione e rivela l’intero spettro di informazioni strutturali e dinamiche che sono impresse nelle sequenze proteiche a livello evolutivo.
“Stiamo sviluppando il nostro modello per catturare informazioni più precise sulla struttura e la dinamica rispetto a quanto possano fare i principali database proteici attualmente disponibili, come il PDB”, afferma Advaith Maddipatla, dottorando nel gruppo di Bronstein e primo autore dello studio.
L’obiettivo è consentire ad AlphaFold, guidato da esperimenti, di prevedere il grado di eterogeneità di una struttura molecolare, generando così un set di dati per il riaddestramento dello strumento.
“Ogni nuova struttura modellata può migliorare le previsioni successive e avvicinare AlphaFold, basato su esperimenti, alla realtà fisica come mai prima d’ora”, afferma Bronstein. “Con questo approccio, dovrebbe essere possibile sistemare tutte le informazioni strutturali nel PDB entro un paio d’anni.”
Quando la “sfocatura” strutturale è il risultato desiderato
Oltre a prevedere le strutture a partire dalle sequenze, il team mira a consentire ad AlphaFold, guidato dagli esperimenti, di ricostruire insiemi strutturali plausibili a partire da dati sperimentali “rumorosi”. Questo approccio aiuterà a recuperare le informazioni mancanti da questi set di dati.
“A differenza delle strutture cristallografiche statiche utilizzate per addestrare AlphaFold, la ‘sfocatura’ strutturale è proprio il segnale che stiamo cercando”, afferma Bronstein.
I ricercatori dell’ISTA stanno sviluppando uno strumento per prevedere in dettaglio le dinamiche e l’eterogeneità strutturale delle proteine. Inoltre, si propongono di determinare con quale frequenza tale flessibilità si manifesti in natura.
“Prevedere questa naturale ‘sfocatura’ delle proteine a partire dalle sequenze e dai dati rumorosi potrebbe in futuro migliorare la modellazione di grandi complessi proteici e far progredire la progettazione inversa delle proteine”, afferma Bronstein. Fondamentale nella bioingegneria e nella scoperta di farmaci, la progettazione inversa delle proteine, nota anche come ripiegamento inverso, è il processo di progettazione di sequenze che si ripiegano in una specifica struttura tridimensionale.
Gli scienziati sostengono che il futuro della progettazione strutturale debba estendersi alla progettazione di insiemi di strutture in funzione del tempo, mostrando come le strutture cambiano nell’arco di millisecondi.
“Alcune proteine attraversano molto rapidamente conformazioni funzionalmente importanti”, afferma Schanda. “Vogliamo che il nostro modello sia in grado di visitare tutte queste conformazioni.”
Aprire la strada a modelli predittivi “consapevoli della sperimentazione”.
Una versione precedente di questo studio , ora pubblicata su Nature Biotechnology , è stata presentata per la prima volta alla International Conference on Machine Learning (ICML) del 2025. Quest’anno, lo studio di follow-up del team , incentrato sull’ottimizzazione del tempo di inferenza del modello, è stato accettato per l’ICML 2026. Introducendo un framework di ottimizzazione generale per il tempo di inferenza, questo secondo studio affronta le limitazioni del processo di diffusione inversa, la tecnica utilizzata nei modelli di apprendimento automatico generativo per ricostruire i dati dal rumore.
In un terzo studio , pubblicato sul server di preprint bioRxiv , i ricercatori hanno applicato il loro modello AlphaFold, guidato da esperimenti, per scoprire conformazioni precedentemente non modellate della proteina β2 – microglobulina a partire da dati cristallografici. “Questo studio dimostra chiaramente che AlphaFold, guidato da esperimenti, può scoprire conformazioni che i flussi di lavoro convenzionali di affinamento strutturale non riescono a individuare”, afferma Maddipatla, primo autore di tutti e tre gli studi.
“AlphaFold, basato su esperimenti, apre la strada a futuri modelli predittivi che siano ‘consapevoli degli esperimenti’ e che catturino la natura d’insieme delle strutture proteiche. In definitiva, vogliamo trasformare il nostro modello da una semplice dimostrazione di fattibilità in uno strumento standard per la ricerca biologica, integrandolo nei framework di predizione strutturale”
Abstract
AlphaFold3 predice strutture proteiche altamente accurate a partire dalla sequenza, ma tende a collassare in un’unica conformazione dominante, anche quando la struttura sottostante è intrinsecamente eterogenea. Inoltre, le sue predizioni non tengono conto delle condizioni sperimentali che possono alterare la conformazione locale della sequenza. In questo lavoro, dimostriamo che AlphaFold3 può essere guidato per corrispondere ai dati ottenuti da spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), cristallografia a raggi X e microscopia elettronica criogenica (cryo-EM), nonché da combinazioni di queste tecniche. Il nostro approccio può anche incorporare dati che forniscono esplicitamente informazioni sulla dinamica, come i parametri d’ordine risolti a livello di sito. Dimostriamo che questa metodologia genera insiemi strutturali compatti i cui osservabili mediati sull’insieme concordano con i dati sperimentali, con un numero inferiore di violazioni dei vincoli di distanza rispetto alle strutture NMR risolte tradizionalmente e con conformazioni alternative non modellate che vengono scoperte nella densità elettronica. Questa metodologia apre la strada a modelli predittivi basati su dati sperimentali che generano insiemi strutturali coerenti con le misurazioni, potenzialmente su più modalità, e che possono essere ulteriormente perfezionati verso insiemi termodinamicamente fondati mediante l’incorporazione di considerazioni energetiche.
Principale
Le proteine sono entità intrinsecamente dinamiche, che assumono stati conformazionali variabili in risposta all’ambiente circostante e per svolgere le proprie funzioni biologiche. Sebbene tecniche sperimentali come la cristallografia a raggi X, la spettroscopia NMR e la crio-microscopia elettronica osservino le medie di insieme di queste strutture macromolecolari, i modelli strutturali delle proteine spesso riportano solo la conformazione dominante, trascurando l’eterogeneità conformazionale sottostante.
Partendo dalla scoperta fondamentale che gli amminoacidi in prossimità spaziale all’interno di una struttura proteica co-evolvono 1 , 2 e l’addestramento sulle centinaia di migliaia di strutture cristalline a raggi X determinate sperimentalmente disponibili oggi, modelli basati sul deep learning come AlphaFold 3 , 4 hanno permesso di prevedere la struttura delle proteine con un’accuratezza che si avvicina a quella sperimentale. Tuttavia, l’obiettivo di addestramento di AlphaFold, ovvero prevedere una singola struttura “più probabile”, orienta il suo output verso istantanee statiche, marginalizzando di fatto l’eterogeneità conformazionale codificata nei suoi dati di addestramento. Ciò sottolinea la necessità di nuovi modelli in grado di generare esplicitamente insiemi di strutture proteiche coerenti con le misurazioni sperimentali.
Per colmare questa lacuna, presentiamo un framework per la costruzione di modelli generativi di strutture proteiche basati su esperimenti, in grado di inferire insiemi conformazionali coerenti con i dati sperimentali misurati. L’idea chiave è quella di trattare i predittori di strutture proteiche all’avanguardia (ad esempio, AlphaFold3) come priori strutturali condizionati dalla sequenza e di concepire la modellazione di insiemi come un’inferenza a posteriori delle strutture proteiche, date le misurazioni sperimentali. Studi recenti hanno esplorato modi per incorporare vincoli sperimentali nella predizione della struttura. AlphaLink 5 integra le distanze derivate dalla spettrometria di massa cross-linking come termini di bias nella rappresentazione di coppia di AlphaFold per guidare l’inferenza di singole strutture. Nel presente studio, invece, modifichiamo il processo generativo di AlphaFold3 stesso: le probabilità sperimentali entrano come termini guida durante il campionamento, consentendo il condizionamento diretto su qualsiasi modalità sperimentale per generare insiemi coerenti sia con la sequenza che con l’esperimento.
Risultati
Adattiamo AlphaFold3 per generare ensemble modificando le fasi di diffusione inversa in modo da includere un termine di guida basato sul gradiente derivato dalla verosimiglianza sperimentale. Questo termine introduce una forza dipendente dai dati che indirizza il campionamento verso strutture compatibili con le misurazioni. Un iperparametro di scala controlla l’influenza di questa guida, consentendo l’interpolazione tra output puramente guidati da prior e output fortemente condizionati dai dati. Il nostro framework supporta diverse modalità sperimentali definendo opportune funzioni di verosimiglianza differenziabili. Dopo il campionamento, eseguiamo la minimizzazione dell’energia per correggere le distorsioni geometriche e garantire la plausibilità chimica, una procedura utilizzata in molti modelli generativi, incluso AlphaFold stesso. Applichiamo quindi la selezione dell’ensemble per identificare il sottoinsieme minimo di strutture che meglio spiega le osservazioni sperimentali. Si veda la Figura 1 per una descrizione schematica del metodo proposto e le Sezioni 8.4 (“Problemi inversi della struttura proteica”), 8.5 (“Modelli di cristallografia a raggi X”), 8.6 (“Modelli NMR”) e 8.7 (“Modelli di crio-EM”) per i dettagli algoritmici e di implementazione.
Experiment-guided AlphaFold3 resolves measurement-consistent protein ensembles., Nature Biotechnology (2026). DOI: 10.1038/s41587-026-03166-5
by 