Le sonde fluorescenti hanno rivoluzionato la biologia moderna, consentendo ai ricercatori di etichettare e visualizzare singole molecole in cellule, tessuti e animali viventi. Grazie a questi strumenti, i ricercatori possono osservare in tempo reale l’infezione virale delle cellule, monitorare l’accumulo di scarti cellulari e tracciare i segnali che stimolano la crescita tumorale. Ora, gli scienziati dell’Albert Einstein College of Medicine e del Salk Institute for Biological Studies hanno sviluppato una nuova tecnologia di imaging molecolare che illumina le proteine all’interno di cellule e animali viventi con una chiarezza di gran lunga superiore rispetto al passato. Descritto sulla rivista Nature Methods , il sistema utilizza nanocorpi fluorescenti ingegnerizzati – minuscoli frammenti proteici simili ad anticorpi – che si illuminano solo quando si legano ai loro bersagli specifici.
“Il vantaggio principale del nostro approccio è che il segnale appare solo dove è presente la proteina bersaglio”, ha affermato Vladislav Verkhusha, Ph.D., coautore dello studio, professore di genetica e codirettore del Gruss-Lipper Biophotonics Center presso l’Einstein. “Questo elimina il bagliore di fondo che ha a lungo limitato la precisione dell’imaging intracellulare.”
L’altro coautore corrispondente dello studio è Axel Nimmerjahn, Ph.D., professore al Salk Institute.
Risolvere un problema chiave nell’imaging
Nel corso dell’ultimo decennio, i nanocorpi fluorescenti si sono affermati come strumenti potenti grazie alla loro capacità di legarsi a proteine specifiche nelle cellule viventi. Tuttavia, le versioni convenzionali emettono luce sia quando sono legate ai loro bersagli, sia quando non lo sono, producendo segnali di fondo diffusi che oscurano i dettagli più fini.
Per superare questa limitazione, i ricercatori hanno progettato una nuova classe di sonde chiamate VIS-Fbs (nanocorpi fluorescenti stabilizzabili nel bersaglio nello spettro visibile). Queste sonde si degradano rapidamente se non si legano al bersaglio previsto; solo quando si legano diventano stabili e fluorescenti. Questa fluorescenza “su richiesta” riduce il rumore di fondo fino a 100 volte, consentendo una visualizzazione molto più nitida della posizione e della dinamica delle proteine.
I ricercatori hanno creato versioni delle loro sonde VIS-Fb che emettono fluorescenza in quasi tutto lo spettro visibile , dal blu al rosso lontano, rendendo possibile tracciare simultaneamente più proteine o processi cellulari all’interno della stessa cellula vivente.
Una piattaforma versatile
Anziché creare una singola sonda, il Dott. Verkhusha e i suoi colleghi hanno sviluppato una piattaforma ingegneristica modulare per la costruzione di sonde VIS-Fb adattabili a diversi bersagli ed esigenze sperimentali. Integrando oltre 20 diverse proteine fluorescenti e biosensori in molteplici scaffold di nanocorpi, hanno creato un kit di strumenti flessibile con molteplici funzionalità.
Con questo approccio, è possibile tracciare simultaneamente più proteine in diversi compartimenti cellulari utilizzando sonde VIS-Fb che emettono colori distinti, consentendo una vera e propria visualizzazione multicolore all’interno della stessa cellula. Alcune varianti di VIS-Fb possono anche essere attivate, ovvero accese e spente, tramite la luce, rendendo possibile seguire il comportamento delle proteine nel tempo con elevata precisione spaziale e temporale.
L’integrazione di biosensori per ioni e metaboliti consente inoltre alle sonde di segnalare non solo la localizzazione delle proteine, ma anche la loro attività in tempo reale, fornendo informazioni dirette sull’attività cellulare. Inoltre, la combinazione di segnali di riferimento stabili con la fluorescenza sensibile all’attività permette di effettuare misurazioni ratiometriche che migliorano la precisione della quantificazione dei processi cellulari, anche in ambienti complessi come il tessuto cerebrale vivente.
“L’approccio VIS-Fb ci permette di identificare e tracciare specifiche popolazioni cellulari negli organismi viventi in base alle proteine che esprimono, anziché semplicemente in base alla loro posizione”, ha affermato Natalia Barykina, Ph.D., prima autrice dello studio e ricercatrice post-dottorato nel laboratorio della Dott.ssa Verkhusha.
I ricercatori hanno dimostrato l’efficacia del sistema in una serie di modelli viventi. Nei topi, le sonde VIS-Fb hanno permesso di ottenere immagini precise dell’attività del sistema nervoso centrale, in particolare di neuroni e astrociti, con un’elevata qualità del segnale durante l’attività comportamentale. Negli embrioni di pesce zebra, la tecnologia ha consentito il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti dinamici durante le prime fasi dello sviluppo e in risposta a farmaci che alterano le vie di segnalazione.
“I nostri risultati dimostrano che questa piattaforma di imaging offre una visione molto più chiara e precisa del comportamento delle proteine all’interno dei sistemi viventi”, ha affermato la dottoressa Verkhusha. “Apre la strada allo studio di processi biologici complessi, come la segnalazione cellulare, lo sviluppo e la progressione delle malattie, in modi innovativi.”
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