Il nuovo strumento Ribo-Tweezer è in grado di prelevare singoli frammenti di proteine ​​da un ribosoma in funzione.

Ogni cellula umana possiede milioni di ribosomi che sintetizzano proteine. Per decenni, i biologi hanno considerato i ribosomi come minuscole macchine uniformi. Ora, però, un team della Stanford Medicine sta dimostrando che i ribosomi sono molto più interessanti e complessi di quanto si pensasse in precedenza.

La loro ultima innovazione è un nuovo strumento chiamato Ribo-Tweezer, in grado di prelevare un singolo componente da un ribosoma funzionante. Questa tecnologia sta aprendo nuove prospettive di ricerca. Ad esempio, utilizzando il Ribo-Tweezer per estrarre una proteina dal ribosoma, il team ha fatto una scoperta sorprendente. A quanto pare, quella proteina contribuiva a mantenere le cellule staminali pluripotenti, preservandone di fatto la “staminalità”.

“È un campo di ricerca estremamente complesso”, ha affermato Maria Barna, PhD, professoressa associata di genetica. “Dobbiamo costantemente inventare nuove tecnologie per rispondere a nuove domande”. Lo sviluppo di Ribo-Tweezer e le nuove scoperte sono state pubblicate sulla rivista Molecular Cell .

Il ruolo del ribosoma

Il dogma centrale della biologia è il seguente: il DNA viene trascritto nel nucleo per formare l’mRNA; l’mRNA si sposta nel citoplasma della cellula e incontra un ribosoma; il ribosoma traduce l’mRNA in una catena di proteine, che si ripiegano e svolgono le funzioni della cellula.

Un tempo i ribosomi erano considerati una parte poco interessante di questo processo: mini-macchine costanti, che svolgevano il loro lavoro meccanicamente.

Ma quando Barna era ricercatrice presso l’Università della California, a San Francisco, apprese qualcosa sui ribosomi. Stava studiando un topo mutante le cui vertebre non si sviluppavano correttamente: ad esempio, dalle vertebre cervicali del collo spuntavano delle costole. Era alla ricerca del gene responsabile di questa anomalia. Presumeva che il suo lavoro avrebbe portato a nuove scoperte su come avviene il normale sviluppo.

Quando però trovò il gene, era sicura che ci fosse stato un errore. Secondo una mappa genetica, la mutazione del topo si trovava nel gene che codifica per una delle 80 proteine ​​che compongono il ribosoma. Una studentessa universitaria ritrovò un articolo di un gruppo di ricerca giapponese che aveva identificato la stessa regione di DNA in un altro topo con la stessa anomalia dello sviluppo. Quando li contattò, scoprì che avevano liquidato la scoperta come sorprendente, ma inspiegabile. Quando disse all’altro ricercatore di aver trovato la stessa cosa, lui rimase sconvolto.

“È questo che amo della genetica: ti porta ad esplorare aspetti che non avresti mai pensato di approfondire, indagare o studiare. Ma non si possono negare le conseguenze genetiche”, ha affermato Barna.

Da allora, la comprensione dei biologi sui ribosomi è progredita enormemente. Alcune malattie genetiche sono state attribuite a mutazioni nelle proteine ​​ribosomiali. E diversi tipi di cellule possiedono diversi tipi di ribosomi; ad esempio, esistono ribosomi specifici per il cuore: senza di essi, il cuore non funziona correttamente. Nel 2023, persone provenienti da oltre 200 gruppi di ricerca hanno partecipato al primo incontro internazionale sull’eterogeneità ribosomiale.

Come estrarre una proteina

Il metodo classico per scoprire la funzione di una proteina consiste nel disattivare il gene che la produce. Ma questo funziona solo se la proteina non è essenziale per la sopravvivenza. Molte delle 80 proteine ​​principali del ribosoma svolgono probabilmente ruoli cruciali nell’assemblaggio del ribosoma all’interno del nucleo.

Barna voleva capire cosa facessero quelle proteine ​​ribosomiali dopo che il ribosoma si spostava nel citoplasma e iniziava a lavorare. Circa sette o otto anni fa, il suo gruppo iniziò a discutere su come scoprirlo, disegnando su una lavagna in laboratorio. “Dimentichiamoci di essere biologi”, disse Barna. “Immaginiamo di giocare con i Lego o con un gioco per bambini e di avere questo problema. Cosa possiamo fare?”

Il nome “Ribo-Tweezer” è nato prima ancora che la tecnologia fosse sviluppata. “Pensavamo di inventare una specie di pinzetta gigante per entrare nel citoplasma della cellula e rimuovere letteralmente i singoli componenti di questo enorme macchinario”, ha affermato Barna. “E poi ci sono voluti anni per sviluppare lentamente le tecnologie necessarie a farlo”.

Il Ribo-Tweezer sfrutta un sistema noto come AID2 (auxin-inducible degron 2). Un degrone è come un’etichetta o un’etichetta di indirizzo su una proteina, che indica al sistema di smaltimento dei rifiuti della cellula di eliminarla. I biologi utilizzano il sistema AID2 per individuare e distruggere una proteina specifica.

Barna e i suoi colleghi hanno impostato il loro sistema con il degrone sulla proteina che volevano che il Ribo-Tweezer rimuovesse. Hanno aggiunto un recettore dell’auxina a un’altra proteina ribosomiale, scelta perché non viene aggiunta al ribosoma finché quest’ultimo non è quasi completamente formato e non si è spostato nel citoplasma. Quando trattavano la cellula con auxina, la proteina marcata veniva degradata e rimossa.

“Immaginate il ribosoma come un grande modello Lego, costruito con circa 80 pezzi proteici”, ha affermato Yuxiang Chen, PhD, ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Barna e co-sviluppatore di Ribo-Tweezer. “Con Ribo-Tweezer, possiamo estrarre un pezzo alla volta dal ribosoma e chiederci se abbia una funzione specifica oltre a quella di semplice componente del ribosoma.”

Quando le Ribo-Tweeter attaccano

Il team ha deciso di iniziare con una proteina ribosomiale chiamata RACK1 per via della sua posizione sulla superficie del ribosoma. Quando hanno utilizzato il sistema Ribo-Tweezer per rimuovere RACK1, originariamente scoperta da Daria Mochly-Rosen della Stanford Medicine nel 1991, hanno confermato che la rimozione funzionava e non stressava la cellula.

Poi le cose si fecero strane. Le cellule staminali embrionali di topo hanno un aspetto caratteristico al microscopio, crescendo in ammassi rotondi. La studentessa di dottorato Ching Pin Cheng chiamò Barna per esaminare le cellule prive di RACK1. Erano piatte, con lunghe proiezioni. Barna pensò: “Queste sono cellule staminali neurali. C’è qualcosa che non va”.

Ci è voluto un po’ prima che il team ne fosse convinto, ma l’intuizione iniziale di Barna si è rivelata corretta: quando RACK1 veniva rimosso, le cellule staminali embrionali del topo si differenziavano in cellule con le caratteristiche delle cellule staminali neurali. Ciò implica che RACK1 svolga un ruolo nel mantenere le cellule staminali embrionali nel loro stato embrionale, capaci di trasformarsi in molteplici tipi di cellule. “È stata una sorpresa totale per noi”, ha affermato.

Inoltre, il cambiamento era reversibile: quando il team ha disattivato il sistema Ribo-Tweezer, le cellule sono tornate al loro stato embrionale.

Barna e i suoi colleghi hanno studiato quali altri cambiamenti si verificassero nella cellula in seguito alla rimozione di RACK1. Hanno scoperto che la rimozione di RACK1 induceva il ribosoma ad aumentare rapidamente la produzione di una serie di fattori di trascrizione. Anshul Kundaje, PhD, professore associato di genetica e informatica, ha utilizzato l’apprendimento automatico per confermare che questi fattori di trascrizione si spostavano nel nucleo e influenzavano la trascrizione di geni che probabilmente sono importanti per la “staminalità”, ovvero per mantenere la cellula in uno stato embrionale. Questa era una scoperta inedita; nessuno sapeva che il ribosoma fosse coinvolto in questo processo.

Le osservazioni del team mostrano cosa accade quando si rimuove RACK1 dal ribosoma, un evento che normalmente non si verificherebbe. Ciò significa che RACK1 deve svolgere un ruolo cruciale nel mantenere le cellule staminali embrionali nel loro stato embrionale.

Ribo-Tweezer apre nuovi orizzonti

Le cellule di un organismo condividono lo stesso DNA, ma svolgono funzioni diverse utilizzando proteine ​​diverse. Per svolgere tali funzioni, è necessario che regolino la produzione di determinate proteine. Mentre molti biologi si sono concentrati su come la cellula regola la fase iniziale di trascrizione dei geni in mRNA, il team di Barna sta facendo luce su come i ribosomi trasformano l’mRNA in proteine ​​e su come regolano questo processo.

Il team ha anche utilizzato Ribo-Tweezer per rimuovere altre proteine ​​ribosomiali dalle cellule staminali. Stanno scoprendo che diverse proteine ​​ribosomiali sono responsabili della produzione di set distinti di proteine, il che significa che quella che viene considerata una macchina generica è in realtà altamente specializzata. Barna spera di poter infine applicare il sistema a cellule non staminali per approfondire il ruolo dei ribosomi in diversi tipi cellulari.

In futuro, potrebbero esserci dei modi per intervenire sui ribosomi coinvolti nelle malattie. Le mutazioni nelle proteine ​​ribosomiali possono portare a condizioni insolite, come una mutazione che causa la nascita di bambini senza milza. Anche alcuni tumori sono causati da mutazioni nelle proteine ​​ribosomiali. Un giorno potrebbe essere possibile colpire queste mutazioni con tecniche di editing genetico, o persino con farmaci.

“È davvero gratificante poter esaminare il nuovo modello di regolazione genica e le sue implicazioni per la salute e le malattie”, ha affermato Barna.

Punti salienti

• Ribo-Tweezer consente la rimozione rapida, specifica e reversibile delle proteine ​​ribosomiali.

• Ribo-Tweezer consente una rimozione delle proteine ​​ribosomiali più rapida e specifica rispetto ai sistemi di degron convenzionali.

• RACK1 svolge un ruolo nell’accoppiamento traduzione-trascrizione e nella pluripotenza delle cellule staminali.

• Le proteine ​​ribosomiali svolgono ruoli specializzati e non sovrapposti nel controllo della traduzione.

Riepilogo

Il ribosoma è un ribozima, ma agisce anche come regolatore dinamico dell’espressione genica. Sebbene la composizione delle proteine ​​ribosomiali (RP) vari, analizzare i contributi funzionali delle singole RP al di là dei loro ruoli di mantenimento è difficile a causa della mancanza di strumenti per la manipolazione in situ . In questo studio, abbiamo sviluppato Ribo-Tweezer, un sistema basato su degroni direttamente ancorato ai ribosomi maturi che consente la deplezione rapida, reversibile e selettiva di specifiche RP. Utilizzando Ribo-Tweezer in cellule staminali embrionali di topo (mESC), abbiamo scoperto un ruolo precedentemente non caratterizzato per RACK1 nel controllo del destino delle cellule staminali attraverso la regolazione traslazionale delle reti trascrizionali a dita di zinco e dell’espressione dell’elemento nucleare intersperso lungo-1 (LINE1). Questo accoppiamento traduzione-trascrizione fornisce un meccanismo attraverso il quale il controllo della traduzione viene ulteriormente amplificato nella regolazione genica. Programmi traslazionali distinti indotti dalla deplezione di RPLP0 e RPLP1 dimostrano ulteriormente le funzioni regolatorie specifiche delle RP nella traduzione. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che Ribo-Tweezer è una piattaforma potente che ha fatto luce sulle funzioni selettive delle proteine ​​ribosomiali nella regolazione genica, conferendo un significato biologico all’eterogeneità dei ribosomi.

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