Svelato il mistero della scomparsa degli anfibi nella foresta atlantica brasiliana grazie ai musei

Un viaggio nel passato per comprendere le epidemie moderne

Negli ultimi decenni, il nostro pianeta ha affrontato una crisi ecologica senza precedenza, caratterizzata dalla rapida diffusione di specie invasive e patogeni mortali. Tra le emergenze sanitarie che colpiscono la fauna selvatica, una delle più devastanti riguarda il declino e l’estinzione di centinaia di specie di anfibi in tutto il mondo. Al centro di questa catastrofe ecologica c’è un microscopico fungo chitridio, noto scientificamente come Batrachochytrium dendrobatidis, spesso abbreviato in Bd. Questo organismo invisibile agli occhi attacca la pelle delle rane e dei rospi, compromettendo funzioni vitali come l’equilibrio dei Sali minerali e l’idratazione, portando spesso l’animale alla morte per chitridiomicosi.

Il picco di queste scomparse globali si è verificato tra gli anni settanta e gli anni ottanta del ventesimo secolo, un periodo temporale precedente alla scoperta formale del fungo avvenuta nel millenovecentonovantanove. Questo scarto temporale, noto agli scienziati come ritardo di rilevamento, ha generato per anni intensi dibattiti nella comunità scientifica. Molti ricercatori si sono chiesti se le epidemie storiche fossero realmente causate dall’arrivo improvviso di un ceppo altamente aggressivo o se il patogeno fosse già presente da secoli in forma silente. Per risolvere questo enigma, un gruppo internazionale di ricercatori ha deciso di compiere un vero e proprio viaggio nel tempo, analizzando i campioni biologici conservati nei musei storici.

Il fungo assassino e la sua diffusione globale

Il fungo Bd non è un blocco monolitico, ma comprende diverse linee genetiche con caratteristiche ecologiche e livelli di aggressività molto differenti. La più pericolosa è la linea panzootica globale, identificata con la sigla Bd-GPL, considerata un invasore ipervirulento responsabile della maggior parte delle estinzioni di anfibi registrate sul pianeta. Esistono tuttavia altre linee genetiche più antiche e localizzate, come la linea brasiliana Bd-Brazil, che solitamente intrattengono un rapporto di lunga coevoluzione con le popolazioni locali, mostrando una virulenza inferiore.

La foresta atlantica brasiliana rappresenta un punto cruciale per la biodiversità globale, ma la sua storia epidemiologica è particolarmente complessa a causa della coesistenza di diverse varianti del fungo. Tra il millenovecentosettantanove e il millenovecentottantadue, la Stazione Biologica di Boracéia fu teatro di una delle scomparse di anfibi più documentate e drammatiche della regione. Per decenni, gli scienziati si sono divisi tra due ipotesi contrapposte:

• Ipotesi del patogeno enzootico: il fungo era già presente da molto tempo nella regione e i declini sono stati causati da fattori ambientali o climatici.

• Ipotesi del patogeno in espansione: il fungo è arrivato improvvisamente sotto forma del ceppo aggressivo Bd-GPL, scatenando un’ondata epidemica catastrofica.

L’importanza cruciale dei campioni conservati nei musei

Per stabilire quale delle due ipotesi fosse quella corretta, i ricercatori hanno esaminato trecentoventisette esemplari di rane conservati con cura presso le collezioni storiche dello Smithsonian National Museum of Natural History. Questi animali erano stati raccolti in diversi decenni, offrendo una finestra temporale unica che attraversa sia gli anni precedenti che quelli successivi alla crisi del millenovecentosettantanove.

Applicando tecniche di diagnostica molecolare avanzata, tra cui la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR), l’analisi digitale delle gocce (ddPCR), l’istopatologia con colorazioni specifiche come il metodo PAS, e il genotipaggio basato su polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), il team ha ottenuto risultati inequivocabili.

Prima del millenovecentosettantanove, su centinaia di rane analizzate, nessun campione è risultato positivo alla presenza del fungo, dimostrando che l’infezione era assente nella fase precedente al declino. Subito dopo il collasso ecologico, la percentuale di animali infetti è schizzata vertiginosamente verso l’alto, superando il cinquanta percento nei campioni degli anni ottanta. Le analisi genetiche hanno confermato che l’ondata iniziale fu guidata esclusivamente dalla linea ipervirulenta Bd-GPL, mentre varianti locali come Bd-Brazil e forme ibride sono comparse solo negli anni successivi.

Oggi, le popolazioni di anfibi che frequentano la stessa area mostrano una prevalenza stabile dell’infezione, indipendentemente dalla loro storia passata di declino. Questo indica che i sopravvissuti e le nuove generazioni hanno sviluppato una maggiore tolleranza genetica nei confronti del patogeno, trasformando un’epidemia distruttiva in una convivenza di tipo enzootico.

Approfondimenti tecnici dettagliati sulla ricerca scientifica

• Metodologia di campionamento e decontaminazione: per prevenire la contaminazione crociata nei barattoli di conservazione museale, ogni singolo esemplare è stato risciacquato con etanolo al settanta percento diluito con acqua sterile. Sono stati eseguiti controlli di sottomissione dei tamponi sulle pareti interne dei barattoli di stoccaggio (jar swabs), confermando l’assenza totale di DNA fungino libero nei contenitori.

• Estrazione e integrità del DNA storico: il DNA è stato estratto utilizzando un protocollo fenolo-cloroformio modificato di quattro giorni in un laboratorio dedicato al DNA antico. L’integrità molecolare è stata valutata misurando la concentrazione di DNA a doppio filamento (dsDNA), DNA a singolo filamento (ssDNA), e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti mediante il sistema elettroforetico automatico Agilent TapeStation. Sebbene i campioni più vecchi mostrassero frammentazione chimica, la dimensione media dei frammenti nei campioni degli anni settanta superava la lunghezza dell’amplicone bersaglio della qPCR stimata in circa centoquarantasei coppie di basi, escludendo falsi negativi dovuti alla degradazione del DNA.

• Validazione diagnostica incrociata: l’affidabilità dei risultati molecolari è stata confermata da un accordo quasi perfetto tra i test qPCR e ddPCR, con una concordanza complessiva del novantaquattro percento. Inoltre, l’analisi istopatologica condotta tramite colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione istochimica acido periodico di Schiff (PAS) ha permesso di visualizzare chiaramente gli sporangi fungini nei tessuti cutanei ventrali e interdigitali, confermando la presenza della malattia e riducendo al minimo i falsi positivi iniziali.

• Modellazione statistica: l’andamento temporale della prevalenza dell’infezione è stato stimato mediante modelli additivi generalizzati (GAM) con distribuzione binomiale ed errore corretto tramite la massima verosimiglianza ristretta, evidenziando un effetto non lineare statisticamente significativo dell’anno di raccolta sulla probabilità di infezione.

Traduzione abstract. La disponibilità dello studio completo, in accesso libero o riservato, è verificabile tramite il link del DOI nel box sotto se disponibile.

Abstract

Poiché l’attività umana accelera la diffusione di agenti patogeni e altre specie invasive, ricostruire le dinamiche iniziali, spesso criptiche, di invasioni non rilevate è diventata una sfida centrale nell’ecologia delle malattie e nella biologia delle invasioni. In questo studio, sfruttiamo esemplari museali per ricostruire l’invasione di Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), un fungo panzootico responsabile della perdita di biodiversità globale degli anfibi, attraverso periodi di declino storicamente enigmatici nella Foresta Atlantica brasiliana. Sono state proposte due ipotesi per spiegare le dinamiche storiche di Bd in questa regione: una persistenza enzootica a lungo termine o una recente invasione epizootica coincidente con i periodi di declino. Utilizzando screening molecolari, istopatologia e genotipizzazione di esemplari museali e moderni, non abbiamo trovato alcuna prova di infezione da Bd prima del declino, seguita da un’infezione diffusa immediatamente dopo. Solo il lignaggio panzootico globale (Bd-GPL) è stato rilevato durante il primo anno di campionamento successivo al declino, il che implica che la sua invasione sia stata la causa delle perdite regionali. La prevalenza dell’infezione è variata tra le specie in seguito al declino, riflettendo probabilmente interazioni specie-specifiche tra la suscettibilità di base e il rischio di esposizione ecologica. Le popolazioni ospiti attuali mostrano una prevalenza più uniforme, indipendentemente dalla storia del declino, in linea con l’evoluzione della tolleranza al patogeno in condizioni enzootiche. Nel complesso, questi risultati forniscono la prima prova sito-specifica che collega l’invasione di Bd-GPL all’enigmatico declino degli anfibi in Brasile e dimostrano il potenziale delle collezioni museali per risolvere le dinamiche del ritardo di rilevamento nelle malattie infettive emergenti.

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