Neuroni umani ingegnerizzati ricostruiscono i circuiti danneggiati del midollo spinale.

Le lesioni del midollo spinale colpiscono circa 15-20 milioni di persone in tutto il mondo, causando spesso disabilità permanenti a livello di movimento, sensibilità e autonomia. Tali lesioni possono essere particolarmente devastanti quando si verificano a livello del collo, dove i circuiti spinali danneggiati interrompono i segnali che controllano il diaframma, il principale muscolo utilizzato per la respirazione.

Nonostante i progressi nella cura d’urgenza e nella riabilitazione, non esistono terapie approvate per ricostruire i neuroni e le connessioni perse in seguito a una lesione del midollo spinale. Tuttavia, una nuova ricerca condotta da scienziati del Gladstone Institutes offre la speranza di un trattamento rigenerativo in futuro.

Lo studio, pubblicato su Science Translational Medicine , dimostra che gli interneuroni spinali derivati ​​da cellule staminali umane – cellule fondamentali per la respirazione e il movimento – possono sopravvivere dopo essere stati trapiantati in ratti feriti , connettersi con i circuiti neurali degli animali stessi e migliorare la funzione motoria legata alla respirazione.

“Le lesioni del midollo spinale sono state a lungo considerate difficili da riparare perché il corpo non ricostruisce naturalmente le connessioni neurali che vengono perse”, afferma Lana Zholudeva, Ph.D., ricercatrice del Gladstone Institute e prima autrice del nuovo studio.

“Questo studio dimostra che un tipo specifico di interneurone spinale umano può essere ingegnerizzato a partire da cellule staminali e trapiantato in un midollo spinale lesionato, dove le cellule non solo sopravvivono, ma formano anche nuove vie per riparare le reti danneggiate.”

Trasformare le cellule staminali in neuroni

Il midollo spinale contiene molti tipi diversi di neuroni interconnessi, o “interneuroni”. Come dei cavi di collegamento biologici, queste cellule possono aiutare a collegare i neuroni che devono comunicare attraverso un circuito. Il team di Gladstone si è concentrato su un sottotipo chiamato “interneuroni V2a“, che sono cellule di relè coinvolte nel controllo del movimento.

Precedenti studi condotti dal team di Zholudeva e da altri ricercatori in tutto il mondo hanno dimostrato che queste cellule sono coinvolte nel recupero dopo una lesione traumatica del midollo spinale , anche in circuiti coinvolti nella respirazione e nella deambulazione.

Per verificare se il trapianto di nuovi interneuroni V2a potesse favorire la guarigione del midollo spinale in seguito a lesioni, il team di Zholudeva ha innanzitutto sviluppato metodi per creare le cellule in laboratorio, basandosi su quasi un decennio di lavoro dedicato alla creazione di interneuroni spinali derivati ​​da cellule staminali per la riparazione del midollo spinale.

L’approccio è nato dalla collaborazione tra Zholudeva, Michael Lane, Ph.D., Shelly Sakiyama-Elbert, Ph.D., e l’ex scienziato del Gladstone Todd McDevitt, Ph.D., inizialmente utilizzando cellule staminali embrionali di topo per generare popolazioni definite di neuroni spinali. Da allora si è evoluto verso terapie clinicamente rilevanti basate su cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Presso il Gladstone Institute, Zholudeva e i suoi colleghi hanno ulteriormente perfezionato questi metodi per creare interneuroni V2a umani trapiantabili, ottimizzati per riparare i circuiti spinali danneggiati.

“Ci sono voluti circa un anno e mezzo di tentativi ed errori per mettere a punto la ricetta giusta per creare questo particolare neurone a partire da cellule staminali, ma ne è valsa davvero la pena”, afferma Deepak Srivastava, MD, presidente e ricercatore senior del Gladstone Institute e autore principale del nuovo studio.

I ricercatori si sono inoltre assicurati che le cellule finali potessero essere congelate in provette e successivamente scongelate per l’uso, un fattore chiave che potrebbe in definitiva consentire l’impiego della terapia cellulare in una sperimentazione clinica sull’uomo.

Un nuovo metodo per riparare i danni al midollo spinale

Zholudeva e i suoi colleghi hanno trapiantato interneuroni spinali umani in ratti adulti una settimana dopo una lesione al midollo spinale cervicale. Le lesioni in questa regione del collo sono tra le forme più comuni di lesione del midollo spinale nell’uomo e spesso interrompono i circuiti neurali che controllano la respirazione.

“La respirazione è un processo evolutivo conservato in molte specie, ben definito dal punto di vista anatomico e funzionale, e di diretta rilevanza per le persone che vivono con lesioni del midollo spinale di alto livello”, afferma Zholudeva. “Era il circuito ideale da utilizzare come banco di prova per valutare il potenziale terapeutico del nostro approccio di trapianto.”

Due mesi dopo il trapianto, le nuove cellule non solo sono sopravvissute all’ambiente ostile del sito della lesione, ma hanno anche formato connessioni con le cellule vicine nel midollo spinale. Quando i ricercatori hanno attivato il sito del trapianto, hanno osservato un aumento dell’attività nel diaframma.

In un secondo momento, hanno attivato i neuroni del tronco encefalico dei ratti, che si estendono dal cervello al midollo spinale, e hanno scoperto che le cellule trapiantate si attivavano in risposta.

In condizioni normali, la differenza nella respirazione degli animali era minima. Tuttavia, quando gli animali venivano esposti a bassi livelli di ossigeno o ad alti livelli di anidride carbonica – condizioni che costringono il diaframma a lavorare di più – la maggior parte dei ratti feriti e non trattati mostrava segni di insufficienza respiratoria. Al contrario, tre quarti dei ratti che avevano ricevuto i nuovi interneuroni V2a superavano le prove senza difficoltà.

“Questa è la differenza tra una persona ferita che prende un raffreddore e finisce di nuovo sotto ventilazione artificiale, e qualcuno che ha sufficienti capacità per affrontare questa sfida”, afferma Zholudeva. “Le cellule trapiantate sembrano fornire proprio questa capacità aggiuntiva.”

Verso terapie umane

Nello studio, il team di ricerca ha esaminato per la prima volta i motivi per cui alcuni trapianti hanno avuto più successo di altri, identificando un sottoinsieme specifico di interneuroni V2a trapiantati che sembravano particolarmente propensi a connettersi con il circuito respiratorio dell’ospite e quindi importanti per la guarigione. Prevedono di approfondire questa scoperta e di continuare a studiare come produrre le cellule più necessarie per la riparazione.

Prima di poter testare la terapia cellulare sugli esseri umani, il team dovrà dimostrarne l’efficacia su animali di taglia maggiore e verificare se funziona altrettanto bene sul midollo spinale lesionato mesi o anni dopo l’infortunio, e non solo nei primi giorni successivi.

Gli scienziati stanno inoltre lavorando per estendere l’approccio oltre la respirazione, ai circuiti che controllano la funzione di braccia e mani , che le persone con lesioni del midollo spinale cervicale spesso identificano come la loro massima priorità per la riabilitazione. Questo lavoro rappresenta l’ultima pietra miliare in un impegno a lungo termine volto a far progredire le terapie con interneuroni spinali dai primi modelli con cellule staminali alla traslazione sull’uomo.

“Abbiamo dimostrato la fattibilità di questo metodo, ovvero che è possibile ingegnerizzare un tipo di cellula ben definito, trapiantarla e far sì che ripari effettivamente un circuito specifico”, afferma Zholudeva. “Ora dobbiamo fare in modo che funzioni in modo più costante, in più circuiti e, infine, sugli esseri umani.”

Riassunto dell’editore

Gli interneuroni V2a sono una classe di interneuroni eccitatori spinali che contribuiscono alla riparazione dei circuiti spinali danneggiati. In questo studio, Zholudeva et al. hanno combinato optogenetica, tracciamento transsinaptico e registrazioni elettrofisiologiche in vivo per dimostrare che le cellule trapiantate da colture arricchite di interneuroni V2a umani possono integrarsi anatomicamente e funzionalmente nei circuiti respiratori del ratto e migliorare il recupero respiratorio dopo una lesione del midollo spinale (SCI). L’analisi trascrittomica ha mostrato che circa il 50% delle cellule donatrici esprimeva marcatori neuronali 2 mesi dopo il trapianto. Quasi tutti i neuroni donatori integrati sinapticamente appartenevano a uno specifico cluster trascrittomico e l’abbondanza di queste cellule era associata al recupero fisiologico. Nel complesso, questi risultati supportano ulteriori indagini sui potenziali vantaggi del trapianto di cellule donatrici arricchite di interneuroni V2a. —Daniela Neuhofer

Abstract

Le lesioni del midollo spinale (SCI) causano un’interruzione irreversibile dei circuiti motori, sensoriali e autonomi, senza che esistano trattamenti riparativi approvati per ripristinare la funzione perduta. Gli interneuroni spinali V2a (SpIN) endogeni sono stati indicati come una componente chiave nel recupero post-SCI, ma l’integrazione di queste cellule con le reti dell’ospite danneggiate dopo il trapianto non è stata ancora esplorata. In questo studio, abbiamo ingegnerizzato interneuroni spinali V2a umani arricchiti a partire da una linea di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che esprime la channelrhodopsina-2 (ChR2) mediante optogenetica e ne abbiamo valutato la maturazione, la connettività e la funzione dopo il trapianto in un modello murino di SCI cervicale. Abbiamo utilizzato registrazioni in vitro con array di multielettrodi per dimostrare l’attività spontanea ed evocata dalla luce, nonché la connettività funzionale tra gli interneuroni spinali V2a arricchiti e i motoneuroni spinali. Dopo il trapianto, il tracciamento con il virus della pseudorabbia dal diaframma ha rivelato neuroni del donatore connessi sinapticamente con la rete motoria frenica danneggiata. Sfruttando l’optogenetica e l’elettrofisiologia multiunitaria, abbiamo dimostrato che gli SpIN umani trapiantati possono sia ricevere (dall’ospite al trapianto) sia fornire (dal trapianto all’ospite) connessioni sinaptiche funzionali con le reti motorie lesionate, riflettendo un relè neuronale funzionale. Analisi trascrittomiche a singola cellula e a singolo nucleo hanno confermato la maturazione del trapianto in molteplici sottotipi di interneuroni eccitatori e popolazioni gliali e hanno identificato geni specifici degli SpIN V2a che formano sinapsi con la rete motoria frenica dell’ospite, tra cui SLITRK5 e PLXNA3. Questo studio dimostra la fattibilità di generare SpIN cervicali umani arricchiti in V2a che stabiliscono una connettività funzionale ospite-trapianto e migliorano il recupero motorio dopo una lesione del midollo spinale

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