Purificazione delle proteine SARS-CoV-2 S (Harvard)
Purificazione delle proteine SARS-CoV-2 S (Oxford)
Purificazione delle proteine SARS-CoV-2 S (Amsterdam)
Produzione e purificazione di proteine del trimero di spike SARS-CoV-2 da cellule CHO
Costruzione ed espressione del plasmide delle proteine del dominio di legame del recettore
Preparazione e analisi del campione mediante LC-MS
Elaborazione dati di dati LC-MS
Modellazione integrativa e simulazione di dinamica molecolare
Espressione e purificazione della proteina S ricombinante da fonti multiple
Conservazione di glicani sottoprocessati su proteina S ricombinante trimerica e derivata viralmente

Biochemistry 2021
Figura 1. Glicosilazione sito-specifica della proteina S ricombinante e derivata da virus da più laboratori. (A) Analisi glicani sito-specifica della proteina S ricombinante espressa e purificata in luoghi diversi. I grafici a barre rappresentano le proporzioni relative di glicoformi presenti in ciascun sito, inclusa la proporzione di PNGS che non sono state modificate da un glicano legato all’N. Le proporzioni di glicani di tipo oligomannoso e ibrido sono colorate in verde. I glicani di tipo complesso elaborati sono colorati in rosa e le proporzioni dei siti non occupati sono colorate in grigio. L’istituto che ha fornito la proteina S per l’analisi è elencato sopra ogni grafico. I dati Texas/Southampton sono riprodotti da Chawla et al. (dati non pubblicati). Le composizioni medie della proteina S ricombinante sono state calcolate utilizzando tutti i campioni.Le barre rappresentano la media ± l’errore standard della media di tutti i campioni ricombinanti analizzati. (B) L’analisi sito-specifica derivata viralmente è stata eseguita utilizzando i dati acquisiti da Yao et al. e classificati nello stesso modo sopra descritto.(32)I dati per i siti N657 e N1158 non possono essere ottenuti e non sono rappresentati. (C) Modello a lunghezza intera che mostra la glicosilazione oligomannosio sito-specifica della proteina S derivata dal virus. Una descrizione di come è stato generato questo modello è disponibile in Materiali e metodi . Sia le proteine che i glicani sono mostrati nella rappresentazione superficiale; il primo è colorato in grigio e il secondo colorato in base al contenuto di oligomannosio come mostrato nella tabella S1 (verde per l’80-100%, arancione per il 30-79% e rosa per lo 0-29%).
Elaborazione di glicani divergenti in siti che presentano glicani di tipo complesso

biochemistry 2021
Figura 2. Confronto di composizioni dettagliate tra siti con stati di elaborazione differenziali. Composizioni di glicani a N234, N1074 e N282. Per tutti i campioni analizzati, i glicani sono stati classificati e colorati in base alle composizioni rilevate. I glicani di tipo oligomannoso (M9-M4) sono colorati in verde. I glicani di tipo ibrido, quelli contenenti tre HexNAc e almeno cinque esosi, sono stati colorati come per i glicani di tipo complesso perché un braccio può essere processato in modo simile. I glicani di tipo complesso sono stati classificati in base al numero di residui di HexNAc rilevati e alla presenza o assenza di fucosio. I glicani centrali rappresentano qualsiasi composizione rilevata più piccola di HexNAc 2 Hex3. Per i glicani ibridi e di tipo complesso, le barre sono colorate per rappresentare l’elaborazione terminale presente. Il blu rappresenta agalattosilato, giallo galattosilato (contenente almeno un galattosio) e viola sialilato (contenente almeno un acido sialico). La proporzione di PNG non occupati è colorata in grigio.
L’espressione dei costrutti RBD monomerici influisce sull’elaborazione del glicano

Biochemistry 2021
Figura 3. Analisi comparativa della glicosilazione dei due PNGS sull’RBD per la proteina S derivata viralmente, la proteina S ricombinante e l’RBD monomerico. (A) Composizioni di glicani sito-specifiche dettagliate dei due siti situati nel RBD di SARS-CoV-2. I dati sulla proteina S ricombinante sono riprodotti da Chawla et al. (dati non pubblicati) e i dati per i siti RBD della proteina S virale sono stati ottenuti da ref(32). I dati sul glicano sito-specifici sono presentati come delineato nella Figura 2 . (B) Composizioni sito-specifiche per i siti N-glicani situati nel RBD di MERS-CoV quando espressi come parte di una proteina S ricombinante solubile rispetto al solo RBD. I dati per la proteina MERS-CoV S sono stati ottenuti da ref(51). I dati sul glicano sito-specifici sono presentati come delineato nella Figura 2 .
Le simulazioni di dinamica molecolare rivelano la relazione tra l’accessibilità e l’elaborazione dei glicani

Biochemistry 2021
Figura 4. Area superficiale accessibile (ASA) di glicani di tipo oligomannosio da simulazioni MD. (A) I valori di ASA sono stati calcolati per ciascun glicano di tipo oligomannosio (M9) per tutte e tre le catene proteiche S. In questo modello, la catena A è modellata nella conformazione RBD “up”. Gli ultimi 50 ns della simulazione sono stati utilizzati per il calcolo e le barre di errore indicano la deviazione standard lungo la traiettoria. La dimensione della sonda utilizzata era di 1,5 nm. Le barre di colore verde rappresentano il contenuto di oligomannosio dei rispettivi siti, calcolato come contenuto medio di glicani di tipo oligomannosio delle proteine S ricombinanti analizzate in questo lavoro (proteine S di Amsterdam, Harvard, Swiss e Oxford). (B) Struttura della proteina S (grigia) con glicani colorati in base ai loro valori ASA mostrati nella rappresentazione superficiale. (C) Grafici che confrontano l’elaborazione del glicano con i valori ASA calcolati,media per le catene A–C, per la proteina ricombinante media per il contenuto di glicani di tipo oligomannosio, la proporzione di glicani contenenti almeno un acido sialico e la proporzione di glicani contenenti almeno un fucosio. Il segnalatoI valori r rappresentano il coefficiente di correlazione del rango di Spearman. (D) Contenuto di glicani di tipo oligomannosio vs ASA per la proteina SARS-CoV-2 S di origine virale presentata come nel pannello C.
The Supporting Information is available free of charge at https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biochem.1c00279.
-
Average recombinant and virally derived S protein site-specific glycan compositions averaged (Table S1), percentage point change in glycosylation on virally derived S protein compared to recombinant S protein (Table S2), site-specific glycan compositions of the two RBD sites, N331 and N343 (Table S3), BLAST alignment of recombinant S proteins (Figure S1), model demonstrating the differential accessibility of the N410 glycan for glycan processing enzymes between trimeric MERS S protein and the monomeric MERS RBD (Figure S2), validation of probe size for ASA measurement (Figure S3), examples of glycans either buried or exposed in all three chains (Figure S4), examples of glycans with bimodal accessibility properties (Figure S5), and glycan–glycan contacts from MD simulations (Figure S6) (PDF)
Spike glycoprotein, UniProtKB P0DTC2 (SPIKE_SARS2); MERS CoV Spike glycoprotein, UniProtKB R9UQ53 (R9UQ53_MERS); raw file accession, MassIVE MSV000087308.
- J.D.A., H.C., and F.S. contributed equally to this work. J.D.A., Y.W., and H.C. performed site-specific analysis. J.D.A., F.S., H.C., P.J.B., and M.C. wrote and edited the manuscript. F.S., L.Z., A.T.S., M.F., and P.J.B. performed MD simulations. W.H., S.C., G.S., P.Y., R.A., and D.R.B. provided monomeric RBD proteins. P.J.M.B., Y.C., H.M.E.D., T.M., J.K., P.P., M.J.W., B.C., D.I.S., and R.W.S. provided recombinant S protein. Y.S. and S.L. produced and collected LC-MS data for viral derived S protein. All authors edited and reviewed the manuscript prior to submission.
- The authors declare the following competing financial interest(s): ExcellGene sells purified trimeric spike protein preparations from CHO cells to commercial companies for internal research and for use in diagnostic applications.