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L’agricoltura molecolare vegetale come strategia contro COVID-19 – La prospettiva italiana

Con le piante possiamo produrre il vaccino. È l’ipotesi di ricercatori di Enea, delle Università di Verona e Viterbo, Cnr e Iss che hanno pubblicato – a metà dicembre 2020 – sulla rivista scientifica internazionale Frontiers in Plant Science uno studio dal titolo Plant Molecular Farming as a Strategy Against COVID-19 – The Italian Perspective. Produrre farmaci usando le piante è quasi una novità a livello mondiale, ma la situazione di emergenza dovuta al Covid-19 rende necessario affiancare ai sistemi tradizionali questa soluzione. “Potremmo ottenere le dosi di vaccino anti-Covid necessarie a soddisfare le esigenze del piano di vaccinazione nazionale in modo rapido, efficace e a costi contenuti”

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha ucciso più di 37.000 persone in Italia e ha causato disagi socioeconomici diffusi. Sono necessarie misure urgenti per contenere e controllare il virus, in particolare kit diagnostici per il rilevamento e la sorveglianza, terapie per ridurre la mortalità tra le persone gravemente colpite e vaccini per proteggere la popolazione rimanente. Qui discutiamo il ruolo potenziale dell’agricoltura molecolare vegetale nella fornitura rapida e scalabile di antigeni proteici come reagenti e candidati vaccini, anticorpi per il rilevamento di virus e immunoterapia passiva, altre proteine ​​terapeutiche e particelle simili a virus come nuove piattaforme vaccinali. Calcoliamo la quantità di infrastrutture e capacità produttive necessarie per far fronte alle prevedibili ondate successive di COVID-19 in Italia unendo le competenze in agricoltura molecolare vegetale, epidemiologia e sistema sanitario italiano. Calcoliamo l’investimento richiesto nell’infrastruttura di agricoltura molecolare che ci consentirebbe di capitalizzare questa tecnologia e forniamo una tabella di marcia per lo sviluppo di reagenti diagnostici e biofarmaci che utilizzano l’agricoltura molecolare nelle piante per integrare i metodi di produzione basati sulla coltivazione di microbi e cellule di mammifero.

introduzione

Il coronavirus 2 correlato alla sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) è un nuovo virus responsabile della pandemia COVID-19, che è la peggiore crisi di salute pubblica di questo secolo1 . L’emergere di SARS-CoV-2 alla fine del 2019 e la sua rapida diffusione nel 2020 hanno posto diverse sfide globali che richiedono nuove soluzioni nella sanità pubblica e nell’ecosistema della ricerca biomedica ( Webb et al., 2020 ). Il primo sta affrontando una pressione acuta sui letti degli ospedali e sul personale medico in prima linea, mentre il secondo sta vivendo un’esplosione nella nuova ricerca, portando a una montagna di letteratura rapidamente diffusa spesso sotto forma di articoli di prestampa accelerati. COVID-19 ha anche evidenziato in modo drammatico la necessità di preparazione e investimenti a lungo termine in piattaforme adatte alla produzione rapida, flessibile e sostenibile di contromisure mediche (diagnostica, vaccini e terapie) contro malattie infettive emergenti, riemergenti e legate al bioterrorismo (Franconi et al., 2018 ; Capell et al., 2020 ).

L’Italia è stato il primo paese in Europa ad affrontare un’epidemia di COVID-19 su larga scala ed è uno dei paesi più colpiti nell’UE ( Remuzzi e Remuzzi, 2020 ). Considerando la situazione con la recrudescenza della malattia dopo l’estate 2020, il nostro sistema nazionale deve essere pronto a reagire prontamente trovando e sfruttando soluzioni nuove e flessibili. Ciò richiede uno sforzo straordinario volto a capitalizzare le competenze nazionali esistenti a diversi livelli e fornirà anche garanzie di fronte a future pandemie. Un grande sforzo dovrebbe essere fatto anche per costruire e potenziare la rete con gli altri paesi al fine di guidare le decisioni in una prospettiva globale tenendo sempre conto delle peculiarità nazionali.

In questo articolo, discutiamo di come l’agricoltura molecolare vegetale potrebbe fornire soluzioni pratiche per affrontare l’epidemia di COVID-19 in Italia. Una volta identificati i vaccini e le terapie efficaci, sarà necessario aumentare la produzione per produrre l’enorme numero di dosi necessarie per proteggere l’intera popolazione. L’attuale distribuzione globale non uniforme della capacità di produzione è uno degli attuali inconvenienti dell’agricoltura molecolare a base vegetale come alternativa realistica ai sistemi di espressione convenzionali ( Capell et al., 2020 ; Tusé et al., 2020). In questa prospettiva, abbiamo definito le categorie di prodotto che trarrebbero maggior beneficio dall’agricoltura molecolare (diagnostica, vaccini e terapie) e abbiamo calcolato le quantità per ciascuna categoria di prodotto che sarebbero necessarie per soddisfare la domanda nazionale, sulla base dei rapporti epidemiologici ufficiali italiani in il periodo febbraio-giugno 2020.

L’agricoltura molecolare vegetale comprende una varietà di diverse tecnologie di espressione, che vanno dalla trasformazione nucleare stabile (piante transgeniche) o trasformazione plastidica (piante transplastomiche) all’espressione transitoria senza integrazione stabile del transgene ( Fischer e Buyel, 2020 ). In quest’ultimo caso, ciò si ottiene mediante l’infiltrazione di piante selvatiche adulte – solitamente tabacco ( Nicotiana tabacum ) o la sua relativa Nicotiana benthamiana – con ceppi di Agrobacterium tumefaciens o vettori virali vegetali ricombinanti che trasportano la cassetta di transgene appropriata ( McDonald e Holtz, 2020). Data l’urgente necessità di diagnosi, vaccini e terapie per una malattia nuova o riemergente in rapida diffusione, solo i sistemi di espressione transitoria forniscono la velocità e la scalabilità necessarie, e quindi ci concentriamo su tali sistemi in questo articolo ( Tusé et al., 2020 ).

Reagenti diagnostici

La gestione efficace di COVID-19 richiede un aumento della capacità diagnostica, in particolare lo sviluppo, la produzione e lo stoccaggio di saggi per rilevare il genoma SARS-CoV-2 e / o gli antigeni stessi o gli anticorpi che induce. I primi test vengono utilizzati per confermare le infezioni (garantendo così misure di quarantena efficaci e cure mediche prioritarie) mentre i test antigenici o test rapidi, in formato point-of-care (PoC), sono emersi come un approccio valido nello screening di grandi dimensioni delle scuole e dei soggetti vulnerabili. comunità. D’altra parte, i test anticorpali vengono utilizzati per valutare l’infezione precedente e lo stato di immunità come base per la sorveglianza epidemiologica e gli studi sui vaccini. Il numero di diversi test è aumentato rapidamente e molti sono stati commercializzati per uso point-of-care. Tuttavia, la loro accuratezza non è stata valutata formalmente e i rischi di bias,Bastos et al., 2020 ). Nonostante ciò, i frequenti test rapidi sono considerati, al momento della revisione di questo documento, uno strumento di “cambio di gioco” prima che i vaccini diventino disponibili ( Rubin, 2020 ).

Test anticorpali accurati per COVID-19 richiedono reagenti di alta qualità, sebbene le differenze tra sensibilità analitica e clinica non siano ancora state definite per nessun test. L’enorme richiesta di kit diagnostici ha evidenziato non solo la grave carenza di reagenti (antigeni e anticorpi ricombinanti) ma anche i mezzi per produrli.

È già stato dimostrato che le piante producono antigeni SARS-CoV ( Demurtas et al., 2016 ). La nucleoproteina (N), espressa transitoriamente in N. benthamiana , è stata riconosciuta dai sieri di pazienti cinesi convalescenti da SARS intorno al periodo dell’epidemia del 2003. Inoltre, la proteina di membrana a tutta lunghezza (M) è stata prodotta nelle piante ma non nei batteri a causa di una tossicità imprevista ( Carattoli et al., 2005 ). Ciò ha fornito la prova del principio che le piante potrebbero essere utilizzate come un sistema di produzione robusto, rapido e flessibile per i reagenti diagnostici della SARS, consentendo potenzialmente lo sviluppo di test immunologici per lo stoccaggio in caso di epidemie ricorrenti di SARS ( De Martinis et al., 2016 ).

Molti altri antigeni sono stati prodotti in piante per uso diagnostico o per la valutazione preclinico / clinica di candidati vaccini, principalmente mediante espressione transitoria in N. benthamiana . Le rese variano ampiamente, come mostrato per una selezione di antigeni nella Tabella 1 . Gli antigeni sono stati selezionati tra quelli che sono stati prodotti transitoriamente in N. benthamianaimpianti e per i quali sono state riportate le rese finali di depurazione. In tutti questi casi, i prodotti sono stati purificati mediante cromatografia di affinità a causa della presenza di tag di affinità N-terminale o C-terminale. Tali tag sono adatti per reagenti diagnostici purché non interferiscano con l’immunoreattività, come in effetti è il caso per tutti gli esempi riportati. L’ampia gamma di rese (1-220 μg / g di massa fogliare fresca, media 77,4 μg / g) mostra che la fattibilità dell’agricoltura molecolare per la produzione di antigeni è squisitamente sensibile alla natura intrinseca del prodotto candidato (e anche al metodo di quantificazione) . Non è ancora possibile prevedere con precisione i rendimenti sulla base di una data sequenza proteica candidata, ed è quindi necessaria una valutazione empirica,Gengenbach et al., 2020 ).

La maggior parte dei test diagnostici immunologici proposti per la rilevazione degli anticorpi SARS-CoV-2 si basano sulla glicoproteina del picco virale a tutta lunghezza (S), sul segmento S1 esterno più corto, sul suo dominio di legame del recettore (RBD) o sulla proteina N ( Freeman et al., 2020 ; Klumpp-Thomas et al., 2020 ; Rosendal et al., 2020 ). Ad esempio, Amanat et al. (2020) hanno riportato un test sierologico basato sull’RBD in un classico disegno ELISA diretto, in cui la piastra è rivestita con l’RBD ricombinante prodotto in cellule di mammiferi o insetti. Tuttavia, la proteina S localizzata in superficie è sotto continua pressione selettiva da parte del sistema immunitario e sarebbero necessari nuovi reagenti ogni volta che un nuovo sottotipo di coronavirus si presenta nella popolazione umana (Ou et al., 2020 ). Al contrario, la proteina N è altamente conservata tra i coronavirus ed è abbondantemente espressa durante le prime fasi dell’infezione, innescando una forte risposta anticorpale. Questo lo rende un reagente diagnostico adatto, in combinazione con altri antigeni come RBD o la proteina M più conservata, per sviluppare test del coronavirus pan-reattivo. Le proteine ​​S e N sono tipicamente prodotte in cellule di mammifero (HEK293) o cellule di insetti infettate con vettori di baculovirus. La proteina N è stata espressa anche in Escherichia coli ( Carattoli et al., 2005 ; Pei et al., 2005), ma le differenze tra i compartimenti citoplasmatici batterico ed eucariotico e l’incapacità dei batteri di effettuare modificazioni post-traduzionali di tipo eucariotico possono ridurre l’affinità di tali antigeni ricombinanti per gli anticorpi presenti nel siero ( Vankadari e Wilce, 2020 ).

La quantità di antigene del coronavirus necessaria per rilevare IgG e IgM nel siero del paziente variava da 50 a 200 ng / pozzetto in un test su piastra standard a 96 pozzetti ( Amanat et al., 2020 ; Freeman et al., 2020 ; Klumpp-Thomas et al. ., 2020 ; Rosendal et al., 2020). Sulla base di ciò, abbiamo calcolato la quantità di reagente diagnostico necessaria per soddisfare la domanda in Italia, ipotizzando un valore medio di rilevamento sensibile (100 ng / pozzetto), con due repliche tecniche per ogni individuo e tenendo conto del fatto che i test immunologici sarebbe richiesto in quantità almeno equivalenti ai test molecolari attualmente utilizzati per la diagnosi di COVID-19. Questo perché test sierologici affidabili sono requisiti fondamentali per studi di follow-up a lungo termine al fine di confermare la stabilità delle risposte anticorpali (neutralizzanti) e per definire la soglia di anticorpi neutralizzanti che previene la reinfezione ( Seow et al., 2020). Nel nostro calcolo per il numero di test sierologici richiesti in Italia, abbiamo considerato il numero di test molecolari eseguiti in Italia tra marzo e giugno 2020 come riportato dal Ministero della Salute Italiano2 . Sulla base di questi criteri, e assumendo rese medie dalla Tabella 1 (77,4 μg / g), due ripetizioni tecniche per ciascun paziente, una biomassa media di 10 g di foglie infiltrate perpianta di N. benthamiana durante l’espressione transitoria e una densità media di piante in una serra di 75 piante per mq si prevede che sarebbero necessari circa fino a 6,5 ​​kg di biomassa vegetale al mese, corrispondenti a 8,7 mq. di spazio serra, per produrre abbastanza reagenti per tutti i test sierologici in Italia ( Tabella 2 ).

Therapeutics

Anticorpi neutralizzanti

Diversi studi suggeriscono che l’immunoterapia passiva basata sull’uso di anticorpi neutralizzanti da pazienti COVID-19 può essere un’arma importante nella lotta contro SARS-CoV-2 ( Tortorici et al., 2020 ). Diverse aziende farmaceutiche hanno già annunciato prove di fase I di anticorpi neutralizzanti monoclonali che proteggevano modelli animali contro SARS-CoV-2 ( Ren et al., 2020 ). Uno di questi studi sta valutando REGN-COV2, un cocktail di due anticorpi che legano regioni non sovrapposte del RBD ( Baum et al., 2020 ; Hansen et al., 2020). Recentemente, Eli / Lilly ha divulgato i risultati preliminari dello studio di fase 2 randomizzato, in doppio cieco e controllato con placebo BLAZE-1 che valuta la combinazione di LY-CoV555 e LY-CoV016, due anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2, per il trattamento di COVID-19 sintomatico in ambito ambulatoriale3 . La coorte di combinazione ha arruolato pazienti di recente diagnosi con COVID-19 da lieve a moderato, che sono stati assegnati a 2.800 mg di ciascun anticorpo o placebo. La terapia di combinazione ha ridotto significativamente la carica virale ai giorni 3, 7 e 11. La terapia di associazione è stata generalmente ben tollerata senza eventi avversi gravi correlati al farmaco. Questi studi forniscono una prima indicazione di una dose terapeutica efficace di anticorpi monoclonali contro SARS-CoV-2 nell’intervallo di 5,6 g per paziente.

Le piante potrebbero fornire un sistema alternativo per la produzione di anticorpi anti-COVID-19 ricombinanti data la produzione efficiente di anticorpi segnalata nelle piante, in particolare mediante espressione transitoria utilizzando vettori virali ( Donini e Marusic, 2019 ). Esempi recenti di anticorpi neutralizzanti di origine vegetale e le loro rese sono elencati nella Tabella 1 . La resa media di circa 870 μg / g suggerisce che l’agricoltura molecolare potrebbe fornire un utile complemento ai sistemi di produzione tradizionali, soprattutto quando gli anticorpi sono richiesti rapidamente e su larga scala.

Nello scenario peggiore, basato sulla situazione italiana a metà marzo 2020, la percentuale di pazienti COVID-19 ricoverati in un’unità di terapia intensiva (ICU) era del 9-11% ( Remuzzi e Remuzzi, 2020 ). Abbiamo calcolato la quantità di anticorpo necessaria per soddisfare la domanda in Italia ipotizzando che tutti i pazienti in terapia intensiva trarrebbero beneficio dall’immunoterapia passiva e che presumibilmente la dose sarebbe stata simile a quella del cocktail vegetale ZMapp per il trattamento dell’Ebola durante l’epidemia del 2014 in Africa occidentale – 9 g per paziente ( Mulangu et al., 2019 ). Sulla base di questi criteri e assumendo nuovamente i rendimenti medi dalla tabella 1(870 μg / g), un recupero finale del 70% di mAb altamente purificato necessario per la via di somministrazione intravenosa e gli stessi valori sopra indicati per la biomassa e la densità delle piante in una serra, prevediamo che circa fino a 153.000 kg di biomassa sarebbero richiesto al mese, corrispondente a circa 204.000 mq. di spazio in serra ( Tabella 2 ).

Altre proteine

Oltre all’immunizzazione passiva e attiva, le proteine ​​antivirali potrebbero fornire un’arma aggiuntiva contro il virus durante la fase di infezione e altri farmaci biologici potrebbero aiutare ad affrontare i sintomi di COVID-19 come la tempesta di citochine provocata dall’ondata iniziale di infezione.

Tra gli inibitori dei virus, le lectine sono particolarmente interessanti dal punto di vista dell’agricoltura molecolare vegetale perché sono prodotte naturalmente in molte piante superiori e si legano in modo reversibile ai carboidrati. Data la frequente presenza di glicani sulla superficie dei virus, le lectine sono state esplorate come antivirali e hanno dimostrato di bloccare il ciclo di infezione da HIV, citomegalovirus, virus respiratorio sinciziale, influenza A e anche diversi coronavirus. In effetti, è già stato dimostrato che più di 20 diverse lectine vegetali bloccano le infezioni da SARS-CoV, probabilmente attraverso il legame selettivo ai glicani sulla proteina S ( Keyaerts et al., 2007 ). Uno dei migliori candidati è la lectina algale griffithsin ( Tabella 1), che mostra una potente attività contro SARS-CoV ma una tossicità limitata verso le cellule umane, ed è stata espressa a livelli elevati nel tabacco con rese medie di 760 μg / g ( O’Keefe et al., 2009 ; Fuqua et al., 2015 ; Hoelscher et al., 2018 ).

Esistono prove preliminari che i peptidi naturali o artificiali possono anche inibire i virus ( Struck et al., 2011 ; Mookherjee et al., 2020 ) e peptidi eterologhi corti sono stati espressi con successo nelle piante indipendentemente o visualizzati sulla superficie di nanoparticelle di virus vegetali o particelle simili a virus (VLP) mediante fusione genetica al gene della proteina del mantello virale ( Lico et al., 2012b ). Inoltre, diversi farmaci approvati sono stati riproposti per COVID-19, compresi i biologici esistenti utilizzati per la terapia anticoagulante ( Barrett et al., 2020 ) e gli immunomodulatori utilizzati per bloccare le vie di segnalazione delle citochine infiammatorie ( Rizk et al., 2020). L’agricoltura molecolare potrebbe ridurre significativamente i tempi ei costi di produzione di tali prodotti, dato che gli inibitori funzionali della trombina e i fibrinolitici ( Abdoli Nasab et al., 2016 ; Pitek et al., 2018 ) così come gli immunomodulatori a base di anticorpi ( Jantan et al., 2015 ) si sono già espressi con successo negli impianti.

Utilizzando la stessa strategia sopra descritta per l’immunoterapia passiva, abbiamo considerato la quantità di griffithsin necessaria in Italia per il trattamento del 10% dei pazienti COVID-19 ricoverati in UTI, basando lo schema posologico su studi preclinici che prevedevano due dosi intranasali di 5 mg / kg massa corporea ogni giorno per 4 giorni ( O’Keefe et al., 2010 ). Si è arrivati ​​a una dose di 3 g, ipotizzando una massa paziente media di 74 kg ( Pierlorenzi, 2010 ). Sulla base di questi criteri, e assumendo ancora una volta le rese medie dalla Tabella 1 (759,5 μg / g) e gli stessi valori sopra indicati per la biomassa e la densità delle piante in una serra, prevediamo che sarebbero necessari 41.000 kg di biomassa vegetale al mese, corrispondenti a 55.000 mq di spazio in serra ( Tabella 2 ).

 

Vaccini

La corsa per produrre un vaccino COVID-19 è iniziata non appena è stata pubblicata la sequenza del genoma SARS-CoV-2, coinvolgendo centinaia di gruppi di ricerca accademici e industriali in tutto il mondo che utilizzano gli approcci basati sulla biotecnologia più innovativi. Finora sono stati registrati 232 studi clinici sul vaccino COVID-19 e in alcuni casi sono già disponibili dati di sicurezza di fase I4 .

I vaccini convenzionali inattivati ​​o vivi attenuati contro COVID-19 possono essere efficaci ma anche difficili da produrre e distribuire ampiamente, oltre a presentare il rischio di tornare alla virulenza. I vaccini a subunità basati su antigeni ricombinanti, come la proteina S / RBD (o VLP che mostrano detti antigeni), sono più attraenti in termini di sicurezza e produzione e possono anche essere prodotti mediante agricoltura molecolare nelle piante. La tabella 1 fornisce alcuni esempi di subunità e vaccini VLP prodotti nelle piante e indica rese medie rispettivamente di 70 e 702,5 μg / g.

Per determinare la quantità di antigene vaccinale necessario per un approccio di prevenzione primaria in Italia ( Tabella 2 ), abbiamo ipotizzato che la dose di un vaccino a subunità solubile sarebbe stata la stessa raccomandata per il vaccino influenzale quadrivalente approvato, ovvero un colpo di 40 μg di ciascun antigene per individuo e che la dose di un vaccino VLP sarebbe la stessa di quella raccomandata per il vaccino contro l’epatite B basato su VLP, ovvero una dose di 120 μg per individuo ( Mulangu et al., 2019 ). Tale calcolo è coerente con i recenti studi di Fase 1 con il vaccino adiuvato con proteina SARS-CoV-2 Spike ricombinante NVX-CoV2373, che ha mostrato una promettente risposta immunogenica e tollerabilità con una dose di antigene di 50 μg, suddivisa in due somministrazioni di 25 μg ogni 21 giorni a parte ( Keech et al., 2020). Anche lo studio clinico di fase 2 in corso NCT04466085 con un altro vaccino basato sul dominio RBD ricombinante della proteina Spike, sta testando dosi comprese tra 50 e 150 μg di antigene per individuo. Abbiamo anche ipotizzato che il 60% della popolazione italiana (36.000.000) avrebbe bisogno di essere vaccinato per ottenere l’immunità di gregge. Sulla base di questi criteri e assumendo nuovamente i rendimenti medi dalla tabella 1(70 μg / g per antigeni solubili, 703 μg / g per VLP) e gli stessi valori sopra indicati per biomassa e densità di piante in serra, si calcola che circa 21.000 kg di biomassa vegetale e 28.000 mq. di spazio serra sarebbero necessari per soddisfare la domanda di un antigene solubile, mentre 9.400 kg di biomassa vegetale e 12.500 mq. di spazio serra sarebbe necessario per produrre quantità sufficienti di vaccino VLP ( Tabella 2 ).

Vaccini a base di antigene

Gli anticorpi neutralizzanti contro i coronavirus spesso bloccano le interazioni tra la proteina S e il suo recettore. Nel caso di SARS-CoV-2, questo è l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) che si trova principalmente sulla superficie delle cellule epiteliali polmonari, sebbene anche in altri tessuti ( Liu et al., 2020 ; Long et al., 2020 ). La proteina S o parti di essa sono quindi le preferite come vaccini candidate, sebbene siano state prese in considerazione anche le proteine ​​N e M. I precedenti vaccini contro il coronavirus (contro SARS-CoV e MERS-CoV) hanno indotto l’immunopatologia mediata da Th2 in modelli animali ei ricercatori si stanno concentrando sulle strategie di ingegneria proteica per ridurre al minimo questo effetto ( Koirala et al., 2020). Un approccio promettente consiste nell’esprimere le parti S1 o RBD della proteina S, concentrando la risposta immunitaria sulle parti della proteina S che interagiscono direttamente con ACE2 e aumentando così la probabilità di suscitare anticorpi neutralizzanti. La superficie S1 / RBD è fortemente glicosilata e queste proteine ​​sono quindi più efficaci come antigeni quando espresse nelle cellule eucariotiche ( Walls et al., 2020 ). La resa più elevata di RBD ricombinante è stata raggiunta nel lievito, raggiungendo 400 mg / L nel supernatante di fermentazione su una scala di produzione fino a 60 L ( Chen et al., 2020). Un altro approccio promettente è la fusione della proteina S o dei suoi componenti nella regione Fc di un anticorpo IgG1 umano, che ne prolunga l’esposizione al sistema immunitario. Una proteina di fusione S-IgG1 prodotta nelle cellule CHO-K1 ha suscitato promettenti risposte immunitarie nei primati ( Ren et al., 2020 ). Secondo gli autori, seguendo il programma di vaccinazione teorico del vaccino Shringrix anti-VZV (due dosi da 50 μg) e considerando una resa di 50 mg / L in cellule CHO-K1, potrebbero essere prodotte 3 milioni di dosi di vaccino ogni 14 giorni in un bioreattore da 3000 litri. Nello scenario italiano, con una soglia di immunità della mandria del 60% (36.000.000 di persone), le 72.000.000 di dosi richieste potrebbero essere prodotte in un singolo bioreattore da 3000 L in circa 1 anno.

La proteina S di diversi coronavirus aviari, suini e murini, nonché il frammento N-terminale della proteina S SARS-CoV, sono stati prodotti con successo in piante di mais, patate, pomodori o tabacco transgeniche mediante trasformazione classica mediata da Agrobacterium , o mediante esposizione sulla superficie dei virus delle piante, e in tutti i casi i prodotti hanno indotto una risposta immunitaria dopo la somministrazione orale ( Tuboly et al., 2000 ; Bae et al., 2003 ; Lamphear et al., 2004 ; Zhou et al., 2004 ) o parto nasale ( Koo et al., 1999). Tuttavia, l’espressione transitoria è più adatta per la velocità e la scala di produzione necessarie per affrontare una malattia a rapida diffusione dal vivo COVID-19. È noto che due società stanno sviluppando un vaccino a subunità vegetale contro COVID-19: Kentucky BioProcessing (Owensboro, KY, Stati Uniti)5 e iBio (Bryan, TX, Stati Uniti)6

VLP e VLP chimerici

I VLP sono nanoparticelle formate da proteine ​​strutturali del virus: assomigliano al virione autentico ma mancano del genoma del virus. I VLP chimerici includono componenti di più di un virus, spesso perché un virus fornisce i componenti strutturali del VLP e un altro fornisce epitopi da visualizzare sulla superficie. I vaccini basati su VLP sono già approvati per l’immunizzazione contro il virus dell’epatite B, papillomavirus, virus della febbre catarrale degli ovini e virus Norwalk ( Balke e Zeltins, 2019 ; Syomin e Ilyin, 2019 ) e più di 100 vaccini candidati basati sulla VLP sono attualmente in fase di sperimentazione clinica7 . Sonoin fase di sviluppo anchediversi VLP chimerici che mostrano peptidi di coronavirus identificati medianteanalisi in silico o docking ( Kalitaa et al., 2020 ; Wang et al., 2020 ). I VLP basati sui virus delle piante possono essere prodotti su larga scala mediante l’agricoltura molecolare ( Lico et al., 2011 , 2012b ; Thuenemann et al., 2013 ). Gli esempi elencati nella Tabella 1 vanno da semplici VLP basati su una singola proteina virale a strutture più complesse contenenti fino a quattro proteine ​​( Marsian e Lomonossoff, 2016 ).

Il forte potenziale dei vaccini VLP prodotti nelle piante è dimostrato dai VLP sviluppati da Medicago Inc. (QC, Canada) per la vaccinazione contro l’influenza stagionale e pandemica, che hanno raggiunto rispettivamente gli studi clinici di fase III e II. Questi vaccini si basano su combinazioni di proteine ​​emoagglutinina di diversi ceppi virali, che si assemblano naturalmente per formare VLP anche in assenza delle altre proteine ​​strutturali del virus influenzale ( D’Aoust et al., 2010 ). Durante la pandemia H1N1 del 2009, la società ha prodotto il primo lotto di vaccini per la ricerca solo 3 settimane dopo aver ricevuto la sequenza A / H1N1 ( D’Aoust et al., 2010 ).

Sebbene le VLP SARS-CoV-2 di origine vegetale non siano ancora state segnalate, la fattibilità di questo approccio è stata dimostrata dalla produzione di successo di altre VLP del coronavirus in cellule di insetti e mammiferi ( Lu et al., 2007 , 2010 ; Bai et al. ., 2008 ; Lokugamage et al., 2008 ). Ciò suggerisce che i VLP SARS-CoV2 potrebbero essere assemblati nelle piante co-esprimendo le proteine ​​M, E e S. Medicago ha annunciato un programma per sviluppare un candidato vaccino COVID-19 basato su VLP nel luglio 2020, combinando la loro tecnologia di particelle simili al virus del coronavirus (CoVLP) ricombinante con adiuvanti di GlaxoSmithKline e Dynavax Technologies per lo studio di fase I.8 . IBio Inc. ha annunciato anche un programma di vaccinazione COVID-19 basato su VLP 6 Questa azienda è stata fondata con il finanziamento della DARPA (Defense Advanced Research Projects Agency) degli Stati Uniti e faceva parte dell’iniziativa Blue Angel fornitura di contromisure mediche in risposta a malattie emergenti, come dimostrato dalla produzione di ∼10 milioni di dosi di vaccino antinfluenzale in solo 1 mese utilizzando il suo9 .

Oltre ai VLP SARS-CoV-2, un’altra potenziale via verso un vaccino COVID-19 basato su VLP è la produzione di VLP chimerici che mostrano epitopi SARS-CoV-2, come precedentemente mostrato per particelle di papillomavirus umano che mostrano antigeni del virus dell’influenza ( Matić et al., 2011 ) e particelle del virus dell’epatite B che mostrano antigeni del virus dell’afta epizootica ( Huang et al., 2005 ). Nel contesto dei coronavirus, questo principio è stato dimostrato fondendo il dominio S1 di SARS-CoV con il dominio transmembrana e C-terminale dell’emoagglutinina del virus dell’influenza aviaria ed esprimendolo con la proteina della matrice 1 del virus dell’influenza aviaria in cellule di insetti ( Liu et al. , 2011). Un’altra strategia di successo prevede la RBD della proteina MERS-CoV S fusa con la proteina strutturale del parvovirus canino VP2, risultando in VLP che conferivano protezione e provocavano anticorpi neutralizzanti ( Wang et al., 2017 ). L’espressione transitoria nelle piante dovrebbe essere in grado di produrre VLP simili su scala più ampia e più rapidamente di qualsiasi sistema basato su cellule coltivate in bioreattori. I virus delle piante potrebbero anche essere utilizzati per visualizzare più epitopi peptidici immunogenici e immunomodulatori ( Lico et al., 2012a ; Santoni et al., 2020 ), fornendo una strategia efficace per indurre risposte immunitarie simultanee contro diversi bersagli e per stimolare diversi componenti del sistema immunitario sistema – innato e adattivo, umorale e cellulo-mediato (Lico et al., 2013 ; Balke e Zeltins, 2019 ).

 

Discussione

In molti paesi, le scuole sono state avviate e i luoghi di lavoro sono stati riaperti per riavviare l’economia dopo gli effetti devastanti del blocco del COVID-19, mentre diversi paesi stanno già sperimentando una seconda ondata epidemica ( Ali, 2020 ). In questo contesto, abbiamo mostrato come l’agricoltura molecolare vegetale possa contribuire a una strategia di risposta efficace in un paese come l’Italia, dove le competenze in questo campo sono principalmente limitate al settore della ricerca. Gli esperti nazionali si sono riuniti per immaginare lo scenario di una seconda ondata epidemica, con una distribuzione e un tasso di infezione simile all’onda primaria, al fine di quantificare il potenziale dell’agricoltura molecolare vegetale come piattaforma di produzione per la produzione di reagenti diagnostici, terapeutici e vaccini .

In tutte le nostre previsioni, abbiamo limitato la tecnologia della piattaforma all’espressione transitoria, perché ciò consente un rapido avvio e aumento della produzione, generando i primi lotti in poche settimane ( Hefferon, 2014 ). Inoltre, la produzione su larga scala di proteine ​​ricombinanti mediante espressione transitoria è già considerata coerente con le buone pratiche di fabbricazione in diversi paesi, che è un prerequisito per la fabbricazione di prodotti farmaceutici ( Fischer et al., 2012 ). L’agricoltura molecolare vegetale richiederebbe solo un investimento minimo rispetto all’espansione dell’infrastruttura del fermentatore per microbi o cellule animali e sarebbe molto più flessibile di fronte a scenari di emergenza come visto con COVID-19.

Recenti investimenti commerciali in impianti di agricoltura verticale automatizzata su larga scala per la produzione di prodotti biofarmaceutici hanno dimostrato che è possibile trattare fino a 7,58 kg di biomassa al mese per mq. ( Holtz et al., 2015 ) e più recentemente Buyel et al. (2017)riferito per un’unità di coltivazione verticale produce 68,25 kg di biomassa al mese per mq. Pertanto, due di queste strutture sarebbero in grado di processare una quantità sufficiente di biomassa in una settimana per soddisfare l’intera domanda italiana di un vaccino a base di VLP (sufficiente per ottenere l’immunità di gregge) e di reagenti diagnostici (sufficienti per testare l’intera popolazione) con solo il 10% di i costi di capitale necessari per l’infrastruttura basata sui fermentatori. Per la produzione di anticorpi neutralizzanti e antivirali come la griffithsin, la nostra proiezione suggerisce che l’agricoltura molecolare vegetale potrebbe fornire capacità aggiuntiva, integrando così altre piattaforme di produzione biofarmaceutica per aumentare la velocità e la scala della produzione nel momento di maggiore necessità.Barbante et al., 2008 ; Rigano et al., 2009 ; Avesani et al., 2010 ) riducendo così i costi unitari ( Nandi et al., 2016 ). Le nostre proiezioni per l’Italia suggeriscono anche che gli investimenti nelle infrastrutture di agricoltura molecolare potrebbero fornire un valido approccio per qualsiasi paese che cerca di migliorare la sua preparazione per una seconda ondata di COVID-19 e future malattie epidemiche o pandemiche. Inoltre, questa tecnologia ha il principale vantaggio di una facile scalabilità che consente di impostare rapidamente la piattaforma sulla base delle esigenze in corso; in uno scenario in rapida evoluzione, come quello che stiamo vivendo, questo aspetto può aiutare ad orientare le decisioni nazionali anche sulla base di esperienze globali, sfruttando la rete globale che si è recentemente costituita.

A questo proposito, per contribuire a consolidare l’agricoltura molecolare in Europa, la rete potrebbe beneficiare del servizio offerto dalle Infrastrutture di Ricerca (IR) dell’UE che si stanno stabilendo in Europa secondo la roadmap ESFRI (programma H2020-EU.1.4.1.2) e sarà pienamente operativo nei prossimi anni. Le IR sono strutture, risorse o servizi, identificati dalle comunità di ricerca europee per condurre e sostenere attività di ricerca di alto livello nei loro domini. In particolare IBISBA (Industrial Biotechnology Innovation and Synthetic Biology Accelerator10 ) è un’infrastruttura di ricerca in biologia ingegneristica che riunisce organizzazioni di ricerca che forniscono servizi sperimentali e in silico per l’industria e il mondo accademico, per accelerare i processi di produzione a base biologica.

Inoltre, riteniamo che investimenti congiunti di finanziamenti pubblici e privati ​​possano aiutare a raggiungere questo ambizioso obiettivo, avendo un forte impatto sul complesso ecosistema sanitario nazionale ed eventualmente contribuendo in una prospettiva globale ad adottare contromisure efficaci in situazioni di emergenza come quella attuale .

 

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